本申请公开一种显微成像系统对焦面快速标定、对焦定位方法及装置。标定方法包括选取待检测屏幕的四个端点和中心点作为标定点，标定点将待检测屏幕划分为四个平面区域；建立四个平面区域的平面方程；求解平面方程，得到平面方程系数。对焦定位方法包括获取待对焦点的缺陷坐标；根据缺陷坐标判定待对焦点所在平面区域；根据待对焦点所在平面区域的平面方程及缺陷坐标，确定待对焦点与待检测屏幕的距离。本申请把屏幕屏划分成四个三角区域，分别进行平面方程拟合，降低因距离引起的累计误差，又因三角形平面使各个点的误差得到了最大程度降低，本申请既避免以手机屏整个区域来做平面导致没有涉及到的角非常模糊的现象，也简化曲面方程拟合。