本发明公开了一种多位点双光子光刺激系统及其刺激方法，该系统包括飞秒激光器、分束模块、第一聚焦模块及自聚焦透镜。本发明还公开了一种多位点双光子光刺激方法，包括以下步骤：飞秒激光器发出飞秒激光，并传输至分束模块，形成多束多个方向的飞秒激光；再经低倍物镜或长焦距透镜进行第一次聚焦，然后再传输至各个刺激位点前的自聚焦透镜进行二次聚焦，最后聚焦于各个刺激位点。本发明通过低倍物镜(或长焦距透镜)和多个自聚焦透镜的组合实现二次聚焦，将飞秒激光引导到多个刺激位点，在三维大范围内的多个位点实现双光子光刺激，又不降低光刺激激发效率；本发明使得数字孔径大幅提高，又能有效地将飞秒激光引导至各个刺激位点上。