本申请属于生物技术领域，公开了一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒及检测方法。本发明所述检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒，包括扩增血流感染病原体游离DNA的靶序列的引物组和检测探针。本发明所述试剂盒针对血浆样本中血流感染病原体肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌的游离核酸DNA具有良好的特异性，能够实现对血浆样本中肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌等血流感染病原体的快速、准确、灵敏的鉴定。本发明所述试剂盒及检测方法操作简便，检测特异性好、灵敏度高、检测范围宽。实验表明，本发明所述试剂盒检测肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌的最低检测限分别为0.2、0.4、0.3CFU/ml。