本发明适用于微生物技术领域，提供了一种大肠杆菌发酵方法，包括：将大肠杆菌接种到发酵底液后，加入发酵补料进行预补料，然后恒温培养发酵；当需要补料时，以递增的补料速度加入发酵补料；当发酵液OD600达到20~35时，停止补料，并添加诱导培养基诱导；继续加入发酵补料至诱导剂消耗完毕；提高加料速度并继续加入发酵补料。本发明实施例提供的大肠杆菌发酵方法，当检测到需要补料时，以递增的补料速度进行补料，能够控制大肠杆菌的生长密度以及残糖浓度，在该条件下添加诱导培养基诱导蛋白表达，配合两段恒速补料策略，显著提高了目标蛋白表达量，在产业化培养时，仍能保持较高的工艺稳定性。