本发明公开了一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，包括以下步骤：步骤1、鸭TLR7基因PCR扩增及回收；步骤2、InFusion进行载体和目的片段的重组；步骤3、菌落PCR检测。本发明在PCR上游引物起始密码子ATG前加入Kodak序列和BamHI酶切位点，这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组，这种克隆方法效率较高，并可通过测序有效地鉴定PCR产物，本发明具有：①快速：仅需要15分钟反应时间；②简单：不受片段酶切位点的影响，无需对片段酶切；③高效：阳性率达95％以上；④无缝：不引入额外的序列等优点。