本发明涉及分子生物学领域，具体而言，提供了一种RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用。本发明提供的RNase作用底物为荧光探针，该荧光探针为具有茎环结构的单链RNA，其中，环部的序列长度为3‑8bp，茎部的序列长度为3‑9bp，5’端和3’端具有0‑2bp的不对称碱基，以及，5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。应用本申请提供的RNAse作用底物来检测待检测样本是否含有RNase污染或污染量时，可简单快捷的得到结果，对于实验物料的质控和实验室环境的监控有较准确的指导意义。