本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，提供了一种DNA酶检测荧光探针与DNA酶活力检测方法及应用。本发明提供一种DNA酶检测荧光探针，该荧光探针为一条具有茎环结构的单链DNA探针，其中，环部序列长度为10‑20bp，茎部序列的长度为10‑20bp，以及，5’端和3’端的不对称碱基长度为0‑5bp，此外，该探针5’端带有荧光基团，3’端带有淬灭基团。该DNA酶检测荧光探针的茎环结构可以提高探针的稳定性，同时提高探针的灵敏度，实现该探针的高灵敏检测，具体地，当该荧光探针保持完整结构存在时，报告基团和淬灭基团距离较近，无荧光信号产生；当该底物被DNA酶酶切断裂并解离后，未淬灭的报告基团发出荧光信号。