本发明公开了一种熊去氧胆酸母液分离提纯的方法，包括如下步骤：S1、溶解熊去氧胆酸；S2、对S1溶液进行酸化，析晶；S3、再次对解熊去氧胆酸进行溶解：S4、回收丙酮；S5、活性碳进行脱色，精滤；S6、抽取丙酮；S7、提取精致结晶物；S8、对浓缩物结晶干燥；本发明采用熊去氧胆酸溶液易容的溶解剂，防止熊去氧胆酸在溶解的过程中造成反应消耗，且溶剂等都不会在溶解的过程中造成消耗，对溶剂等溶液进行析出或者是纯化提取，实现对原理的循环使用，且对熊去氧胆酸进行多次的提取纯化操作，使得熊去氧胆酸能够达到标准的纯度，且本发明对熊去氧胆酸进行脱色处理，防止造成大量的色素残留，影响熊去氧胆酸的品质。