本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括PCR反应液1，PCR反应液2，DNA内控，阳性质控品和阴性质控品；PCR反应液1中包括：用于扩增YIDD突变的引物，DNA内控引物，用于检测YIDD三种突变类型的探针，用于检测YVDD三种突变类型的探针，DNA内控探针，PCR反应缓冲液，dNTPs，酶混合液；PCR反应液2包括：MnCl2，防腐剂。该试剂盒灵敏度高、检测范围广、特异性强、扩增效率高、快速检测、便于保存运输。