本发明提供了一种100bpDNA分子量标准物的制备方法、引物组及其应用，涉及生物技术领域。该制备方法包括使用第一引物、第二引物和搭桥引物，经PCR扩增得到100bpDNA分子量标准物；第一引物为如SEQIDNO.1所示序列，或为和SEQIDNO.1所示序列90％以上同源性的序列；第二引物为如SEQIDNO.2所示序列，或为和SEQIDNO.2所示序列90％以上同源性的序列；搭桥引物的3’端含有与第一引物的3’端10～15bp的反向碱基互补序列；搭桥引物的5’端含有与第二引物的3’端10～15bp的重复序列；PCR扩增产物的长度为100bp。该制备方法操作简单，经济高效。