本发明公开了一种快速检测菌株耐药表型的方法，首先用营养肉汤配制浓度呈梯度变化的抗菌药物稀释液，然后取不同浓度的抗菌药物滴加到质谱仪样品靶板上形成药敏靶板，干燥后备用；用无菌生理盐水配制待检测菌株的标准菌悬液，再用营养肉汤稀释后备用；取稀释后的标准菌悬液依次滴加于制备好的药敏靶板上，形成微滴，然后将其放在湿盒内，置于恒温箱孵育2h～6h，弃药敏靶板上的肉汤；晾干后，再滴加质谱鉴定前处理试剂，结晶后用质谱仪进行微生物鉴定并判读结果。本发明操作简单，耗材少，不依赖于任何耐药机制，可以根据需求包被抗生素及浓度个数，检测快速，结果直观明了，不需要过多的分析，适用范围广。