本发明涉及医学检验技术领域，特别涉及一种S100蛋白的检测试剂盒。该S100蛋白的检测试剂盒包括包被有S100抗体的磁微粒混悬液、样品稀释液、酶结合物、校准品和质控品；样品稀释液为含有螯合剂、防腐剂、蛋白质类稳定剂、分散剂、表面活性剂、阻断剂的Bis‑Tris缓冲液；螯合剂为EGTA，阻断剂为肿瘤清洁抗体1、肿瘤清洁抗体2、肿瘤清洁抗体3或肿瘤清洁抗体4中的一种或两种以上混合物。该S100蛋白的检测试剂盒具有较宽的线性范围，灵敏度和特异性高，实现S100蛋白的快速、自动化检测。