本发明公开了人类Y染色体35个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，所述试剂盒包括扩增35个Y‑STR基因座的特异性引物，其中包括28个低突变Y‑STR基因座，7个快速突变Y‑STR基因座。本发明所述试剂盒包括28个低突变率和7个快速突变、多态性较高的Y‑STR基因座，兼顾了男性家系排查和同一父系不同男性个体之间的区分；本发明所述试剂盒中引物具有特异性强，灵敏度高，分型结果准确的优点，完全能够满足实际案件检验、DNA数据库建设以及亲子鉴定的需要；本发明所述试剂盒具有很强的检材适应性。