本发明涉及一种直接机上溶血酶法双试剂糖化血红蛋白检测试剂盒，包括样本处理剂、反应试剂1和反应试剂2。本发明将用于水解全血样本中的糖化血红蛋白的蛋白酶装在起到溶血作用的样本处理剂中，在使用时可以直接在全自动生化分析仪上一步法溶血并水解全血样本中的糖化血红蛋白，不需要提前进行离线溶血预处理，直接机上溶血更快、更有效。本发明检测试剂盒比传统的糖化血红蛋白检测试剂盒减少一种试剂，在使用时不需要如传统试剂盒将R1a试剂和R1b试剂提前进行混合，可以缩短时间并简化操作。并且，本发明的检测试剂盒对样本处理剂的组分进行了优化，全血样本经样本处理剂溶血处理后得到的溶解产物的稳定性良好，3小时内检测结果的误差在5％以内。