本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，包括1)pHR‑mbIL‑21、pHR‑4‑1BBL和pHR‑MICA质粒载体构建，2)分别用pHR‑mbIL‑21、pHR‑4‑1BBL和pHR‑MICA质粒载体制备重组慢病毒，3)K562‑mbIL‑21‑4‑1BBL‑MICA滋养细胞的制备，4)PBMC细胞的提取，5)NK细胞的体外扩增；本发明提供一种NK细胞的制备方法，采用单独构建表达mbIL‑21、4‑1BBL、MICA三种分子的质粒载体，重组慢病毒感染K562的方法，制备NK细胞，制备方法解决现有技术的缺点，利用IL‑21、4‑1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞用于扩增培养NK细胞，其NK细胞扩增倍数高达890倍，制得NK细胞的纯度到达92.2％，并且不同的PBMC细胞间的扩增倍数重复性好。