本发明实施例涉及临床体外检测技术领域，具体涉及一种稳定高效的HRP酶促底物液及其制备方法与应用。本发明实施例提供的HRP酶促底物液，包括底物液A：无水乙酸钠6‑30g/L，吐温2020‑100mL/L，柠檬酸钠3‑15g/L，柠檬酸4‑20g/L，乙酸0.5‑2.5mL/L，双氧水0.5‑2mL/L，过氧化钠0.006‑0.03g/L；和底物液B：TMB0.2‑3g/L，二甲基亚砜2‑10mL/L，盐酸0.5‑5mL/L，甘油10‑100mL/L，硫代硫酸钠2‑20g/L。本发明实施例中提供的HRP酶促底物液，显色强度强高，同时没有增加本底，检测灵敏度高；显色效果可以持续1小时；并可在2‑8℃条件下稳定放置3年，且抗高温能力强，可抵抗高温天气运输对试剂盒的影响；稳定高效，可满足酶联免疫试剂盒对显色底物液的各项要求。