本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建，S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入，S3、菌的培养，S4、菌体破碎过滤处理，S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备，S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化，本发明涉及生物工程技术领域。该葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，很好的达到了通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，大大提升了提纯效果，很好的降低了提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白的含量，十分有利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用。