本发明公开了一种人脐带间充质干细胞制备方法，属于干细胞制备领域。本发明的制备方法包括采集、分离、换液、传代、冻存、检测、程序降温及储存全过程。以人脐带为材料提取脐带间充质干细胞，采用两种酶两步消化法进行制备，利用消化下来的细胞和消化结束剩余的组织分开培养后传代混合一起培养，提取培养过程中无需加入动物血清，制备过程无需加抗生素，原代分离无需过滤，两种培养方式同期进行，不仅提高了成功率且能在较短的时间得到大量稳定的细胞。本方法原代提取消化时间短，避免了I型胶原酶和分散酶长时间消化对细胞的影响，同时避免原代消化后细胞过滤后细胞数的损失。整个培养周期短，能高效、稳定的获得脐带间充质干细胞。