本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，包括实验材料的准备、单点突变、目的基因片段扩增、表达载体双酶切及T5外切酶处理、转化、阳性转化子检测、测序比对以及碱基缺失。本发明在目的基因突变位点周围分成两段DNA片段，分别设计两对引物F1、R1，F2、R2，其中突变或缺失碱基位点设计在R1、F2中，R1与F2要有至少20bp的同源臂，F1与R2要分别和表达载体插入位置有至少20bp的同源臂，基因片段和载体片段在T5外切酶作用后，利用大肠杆菌自身的修复系统就可以得到含有目标位点的环状质粒，该方法同样适用于多位点碱基突变或缺失。