本发明属于生物工程技术领域，提供了一种利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法。该方法为：将柠檬酸钠或磷酸氢二钾溶解于噬菌体裂解液中，加入乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂，温和涡旋混合，分相形成上、中、下三相的三相体系，完成第一步盐析萃取；向第一步盐析萃取所得下相溶液中加入正丙醇等亲水性有机溶剂，进行第二步盐析萃取，噬菌体在中间相得到富集和纯化。本发明解决了目前噬菌体分离工艺中存在的噬菌体与细菌代谢物难以分离、成本高等问题。该方法工艺简单、分离时间短、回收率高、分离成本低、除杂率高，是一种很有工业应用前景的分离方法。