本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种PET系列载体正向测序引物及测序方法。本发明所提供的PET系列载体正向测序引物位于T7启动子序列上，长度为20‑25bp。本发明还提供了一种PET系列载体测序方法，包括以下步骤：分别采用上述的正向测序引物配置测序反应体系进行PCR，PCR完成后向体系中加入EDTA/NaAC和冷酒精静置，离心收集沉淀，再用乙醇多次进行除杂沉淀，再溶解沉淀后放入到测序仪中进行测序。本发明所提供的PET序列载体正向测序引物进行测序成功率高，特别是浓度较低的模板，成功率能够明显提高，本发明所提供的利用该正向引物测序的方法，成功率高且节约时间，缩短实验周期。