本发明公开了一种马齿苋多肽提取物及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)取干燥后的马齿苋药材，粉碎成粗粉，加入石油醚回流提取，过滤，溶剂挥干；(2)加入水，加入中性蛋白酶，温浸提取，用碱溶液调节pH至9～10，再向其中添加碱性蛋白酶，温浸提取，煮沸灭酶，滤布过滤，减压浓缩，离心保留上清液；(3)将上清液过D101大孔树脂，收集下柱液，用水洗柱，收集水洗液，合并下柱液与水洗液，减压浓缩；(4)加入乙醇，静置后抽滤，减压补水浓缩至无醇；(5)使用截留分子量为2kDa的透析袋，室温下透析，减压浓缩后真空干燥粉碎即得马齿苋多肽提取物。本发明制备的马齿苋多肽提取物蛋白提取率≥53.5％，蛋白含量≥73.8％，且多肽分子量≤2kDa的占比≥92.7％。