本发明公开了一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入不同来源egtABCDE基因簇进行异源表达。实现生物合成麦角硫因。然后对egtABCDE基因簇进行优化表达，包括密码子优化、启动子优化和不同组合表达，同时优化培养基及添加的甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，经过优化表达和优化培养条件，实现了高效生物合成麦角硫因。本发明为微生物系统高效发酵制备麦角硫因奠定了基础，适合于工业化生产应用。