本发明提供了一种硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法，属于藻类培养和应用技术领域，所述提取方法，包括以下步骤：1)将硅藻藻粉与氯仿/甲醇溶液混合进行抽提，将所述抽提液过滤、脱色、去除溶剂得到粗脂肪；2)将所述粗脂肪与NaOH乙醇溶液混合皂化获得皂化液，用正己烷萃取所述皂化液获得游离脂肪酸；3)将所述游离脂肪酸与硫酸甲醇溶液反应后，用生理盐水和正己烷进行萃取，收集上层液，向所述上层液中加入无水硫酸钠后，离心，收集上清液即为多不饱和脂肪酸；所述方法多不饱和脂肪酸的提取率高、纯度好。