本发明公开一种利用酵母组装多个基因片段到py‑2u载体的方法及用途，涉及生物工程技术领域。该方法在需要克隆的目的基因两段添加和py‑2u载体同源的同源序列；将得到的基因分为多个小片段，两段添加单独的酶切位点；每个小片段两端的酶切位点为同一个酶切位点，或不同的单独的酶切位点；每个小片段通过基因合成或PCR扩增得到，产物平端连接到克隆载体或TA克隆到小片段载体；将每个片段用单独的酶切位点进行酶切，回收产物后用于下一步的酵母转化。构建的Py‑2uL可被阿拉伯糖诱导提高其在大肠杆菌中的拷贝数，有利于后续的质粒提取等基因操作；可以稳定快速完成长基因的基因合成和组装，相较常规克隆流程更简便，经济高效。