本发明涉及一种液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒包括以下试剂：(a)校准品，所述校准品含有苯丙氨酸、17α‑羟孕酮和半乳糖标准品；(b)提取液，所述提取液为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈中的至少一种；和(c)流动相，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由(Ⅰ)水、(Ⅱ)甲醇和(Ⅲ)甲酸或乙酸组成，或者，所述流动相A和流动相B由(Ⅰ)水、(Ⅳ)乙腈和(Ⅲ)甲酸或乙酸组成。采用本发明试剂盒检测PKU、CAH和GAL检验快速，检测结果准确且重复性高。