本发明公开了一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，属于兽用抗菌药的临床药代动力学领域。本发明方法包括如下步骤：猪尿液加入适量氢氧化钠溶液调节pH至碱性，然后由乙酸乙酯提取，提取物经过浓缩，并以二氯甲烷:丙酮:氨水等于（1‑6）:（4‑9）:（0.05‑0.5）的混合液作为展开液进行薄层色谱净化，再采用高效液相色谱进行检测。本发明以薄层色谱有效地去除了尿液提取物中所含的内源性物质，避免了其对色谱分析的干扰，同时降低了检测成本，减少了有机溶剂的用量。本发明将薄层色谱与高效液相色谱结合起来，弥补了高效液相色谱仪匹配的检测器在特异性上的不足，拓宽了高效液相色谱法在临床药代动力学中的应用。