本发明公开了一种有机磷降解酶的高密度发酵制备方法，包括：(1)构建机磷降解酶毕赤酵母酵母表达载体并转入到毕赤酵母得到重组毕赤酵母酵母菌株；(2)将重组毕赤酵母酵母菌株依次在一级种子发酵罐、二级种子发酵罐和三级种子发酵罐中进行扩培得到三级种子；(3)将三级种子接入到发酵罐中的高密度发酵培养基中进行诱导培养；期间，通过补料罐补加发酵培养基。本发明主要通过对酵母细胞在种子罐和发酵罐生长和表达的分析，结合酵母生长和外源蛋白表达所需的营养物质、溶氧浓度、培养温度、发酵液的pH值，补料方式以及诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、溶氧、残糖等因素对菌体表达的影响,有效提高了机磷降解酶的产量并降低了生产成本。