本发明提供一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法，属于生物工程技术领域，将黑色素瘤细胞培养后进行破碎，以200ug/次皮下免疫羊驼四次；第四次免疫1周后采集羊驼抗凝血液，分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模版，用第一对引物进行PCR扩增，回收700bp的扩增产物；以700bp扩增产物为模版，第二对引物PCR扩增VHH片段，回收后与pCANTAB5e分别经SfiI两次酶切后连接；将得到的连接产物电转化到TG1感受态细胞，得到黑素瘤纳米抗体库。采用本发明的构建方法构建得到的黑素瘤纳米抗体库，是一个特性很好的免疫文库，适用于特异性地筛选与黑素瘤生长、发育、迁移、增殖等相关的纳米抗体。