本发明公开了一种羧酸酯酶活力的检测方法，包括：1)制备底物溶液；2)吸取Tris‑Hcl缓冲液分别加入到三个小试管中；3)其中，空白对照管加入Tris‑Hcl缓冲液，其它三根试管分别加入待测酶液，恒温水浴，开始计时；4)每间隔30s，每根试管中加入底物溶液，恒温水浴；5)计时3min时，用预冷纯净水暂停反应，405nm标定吸光值，每间隔30s依次测定待测样品的吸光值，根据吸光值数据计算羧酸酯酶活力。本发明在计时3min时，加入预冷的纯净水作为终止液暂停反应，低温抑制酶活性，使得底物对硝基苯酚乙酸酯在纯水中基本不自然水解，确保OD值读数稳定并且读数平行性好，所测定的酶活值非常准确，误差小。