本发明提供一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法，所述发酵培养基中添加有叶酸和氟化钠，该发酵培养基添加叶酸和氟化钠为菌体代谢提供缺乏的营养物质，解除糖酵解途径中对原料的浪费，促进HMP途径的代谢强度，有利于代谢目标产物的高效合成，利用该发酵培养基的核黄素的发酵方法为：将发酵种子液转接至装有核黄素的发酵培养基的发酵罐中培养60～70h，且在发酵罐中分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度，前40h维持葡萄糖浓度为1.0‑1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5‑1.0%，保证各阶段适当的葡萄糖浓度，降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响，利用该方法进行核黄素发酵，可以使核黄素的产量提高至34.6g/L，与未使用该方法相比产量提高76.53%，发酵周期缩短，减少成本。