本发明公开了一种脂肪干细胞的分离及传代培养的方法，包括脂肪采集、获取并制备小块脂肪组织、制备脂肪单细胞悬液、免疫磁珠分选、流式细胞分选、脂肪干细胞培养和脂肪干细胞传代培养。制备小块脂肪组织为1‑2m³左右的脂肪小块，并采用胰蛋白酶联合I型‑II型混合胶原酶时间梯度消化法对脂肪小块进行消化，使得组织消化更彻底，脂肪干细胞培养时所使用的培养箱温度设有37℃，且内部充有含量为5%的CO2气体，满足造血干细胞生长繁殖所需环境及温度，能够提高脂肪干细胞的培养速度，原代培养细胞达到85%融合时,以25%胰蛋白酶将贴壁细胞消化分离3~5分钟,并按照1：3的比例进行接种，保证传代接种后的细胞密度。