本发明公开了一种球孢白僵菌三级培养基及其制备方法，该球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳20‑30份、麦麸20‑30份、土霉素0.001‑0.01份和水30‑50份。还可以包括KH2PO4。通过在培养基配方及所用水中增加土霉素，杀灭自来水中的大部分微生物，进一步保证白僵菌5‑7天生长期培养基低微生物环境状态，让白僵菌在开放式环境中成优势菌种生长。采用本发明提供的培养基进行三级培养，生产的球孢白僵菌高孢粉最高达2300亿/克。