本发明属于生物工程技术领域，涉及一种肌肽水解酶及其突变体，含有该酶及突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组酶的制备方法，重组酶的固定化方法，以及使用该重组酶通过逆水解反应制备左旋体L‑肌肽的方法。与现有技术相比，本发明公开的肌肽水解酶活性高、热稳定性好，使用该酶催化β‑丙氨酸与L‑组氨酸通过直接缩合制备L‑肌肽，避免了常规化学法合成肽的方法中保护和脱保护的步骤，工艺简单、条件温和、绿色环保，因此在L‑肌肽的工业化生产中具有很好的应用前景。