本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种制备人参稀有皂苷Rk3的方法。本发明所述方法先制备冬虫夏草种子液，然后接种至灭菌后的原人参药材上培养至长满菌丝，将长满菌丝的原人参药材取出，干燥，获得含有人参稀有皂苷Rk3的初级产物，分离纯化初级产物获得人参稀有皂苷Rk3。本发明将药用真菌冬虫夏草与原人参药材联合发酵生产人参皂苷Rk3，由此确定了能够制备高含量人参皂苷Rk3的简便工艺，相比原人参药材中人参皂苷Rk3含量提高了22倍。本发明方法能有效直接利用原人参药材，减少前期提取纯化步骤，反应条件温和可控，Rk3产量大，纯度高。