本发明公开了一种快速检测游离雌三醇的试剂盒，包括包被有E3的鼠抗羊IgG‑Fc单抗的磁微粒，标记被载体蛋白修饰过的E3衍生物酶结合物，E3兔多抗抗体溶液，含有E3抗原的校准品溶液，浓缩洗液和底物；其中E3衍生物酶结合物先由E3半抗原与载体蛋白偶联，然后载体通过过碘酸钠氧化辣根过氧化酶标记；E3兔多抗抗体由E3衍生物半抗原偶联大分子蛋白质作为免疫原制备而成。本发明采用磁微粒化学发光的方法定量检测样品中E3的含量，对样品的前处理要求不高，能同时快速检测大批量的样本；试剂以工作液形式提供，检验方法易行，灵敏度高，特异性强，操作简便；且试剂盒结构简单，使用方便，储存运输方便，检测准确、快速、省时高效，适用于大批样品的检测。