本发明公开了属于生物工程技术领域的一种长喙壳菌原生质体的制备方法。所述制备方法，包括步骤如下：1)菌株活化培养：将保存的长喙壳菌接种至MYEA平板培养基中进行活化培养；2)菌丝体制备及收集：在菌落边缘取菌丝块，接入液体培养基中进行摇床培养，用滤膜过滤收集菌丝；3)酶解及原生质体收集：将收集的菌丝体用酶解液酶解，酶解后用渗透压稳定剂洗涤，离心去除酶解液，再用STC溶液洗涤，离心收集，得到原生质体。本发明的制备方法，工艺简单，对设备要求低，易于操作，利用本发明方法进行生产原生质体产量可达5.0‑7.0×107个/ml。