本发明涉及以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用，具体步骤包括：采用对脐带组织进行清洗之后剪成组织段、剥离间质华通氏胶组织；利用含有DMSO的α‑MEM保护剂预处理，置于4‑10℃进行浓度平衡10‑20分钟，后低温离心，去除上清液；加入右旋糖酐或胎牛血清与含有DMSO的α‑MEM保护剂共同构成冻存液，采用程控降温或分级降温的方式对组织进行冻存。本发明的冻存方法可有效保护冻存脐带组织，而且方便进行后续的复苏操作，且复苏后的组织培养出的细胞活性与新鲜组织中的细胞无差别。