本发明公开了一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，包括以下步骤：小反刍兽疫病毒V基因原核表达载体构建pGEX–4T–V；重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE和western–blot鉴定；pGEX–4T–V蛋白纯化和浓度测定；重组pGEX–4T–V蛋白免疫小鼠制备单抗；单抗腹水的制备；小反刍兽疫V基因一个片段（已知序列）的多肽合成制备单抗；真核表达小反刍兽疫V蛋白；三株单抗间接免疫荧光和抗体分型试验等。本发明为小反刍兽疫基因工程疫苗的诊断奠定可靠的技术保障和支撑。