本发明提供的3α‑羟基类固醇脱氢酶突变体，该3α‑HSD突变体由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经点突变所得，所述点突变为选自第25～37位、第100～120位和第145～166位中的至少一个位点的氨基酸替换。通过点突变，获得具有高催化活性的3α‑羟基类固醇脱氢酶突变体蛋白酶，相对于3α‑HSD，能显著提升酶催化活性60％以上，最高可达至原有酶催化活性的2倍。以之作为工具酶极大地提升了试剂盒总胆酸含量酶法检测效率，降低了生产成本，提高了相应产品的市场竞争力。此外，本发明还提供一种编码3α‑羟基类固醇脱氢酶突变体的核苷酸序列及试剂盒。