本发明公开了一种低能N+离子注入诱变长柄木霉高产蛋白酶的方法，涉及生物工程技术领域。包括：将原产酸性蛋白酶的长柄木霉菌株接种在固体发酵平板培养基上；取平板培养基上的长柄木霉菌株利用稀释分离法进行分离纯化；用接种环取在斜面培养基上取长柄木霉孢子，加入无菌水中进行稀释；取孢子悬液均匀涂布于空的无菌培养皿中，然后放入离子注入机的靶室进行离子注入；选取生长状况良好的菌株接种到种子培养基上；将上述选取的菌株接种至发酵液培养基中进行培养。本发明通过不同的营养培养基进行多次培养及分离提纯，同时还使用低能氮离子注入，提高了长柄木霉的酸性蛋白酶的产量，同时获得酸性蛋白酶还具有耐高温性能。