本发明公开了一种B族链球菌核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR反应液1和PCR反应液2，其中PCR反应液1包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，双功能DNA聚合酶，尿嘧啶DNA糖基化酶，dUTP，PCR扩增增强剂；所述PCR反应液2包含锰离子。本发明的优点在于操作方便，检测灵敏度高，特异性好，可重复性强，检测结果快速，试剂无需‑20℃保存，方便储存和运输。采用本发明试剂盒可以对围产期孕妇生殖道分泌物和直肠分泌物等未知样本中的B族链球菌‑DNA进行快速检测，为诊断B族链球菌感染提供可靠的实验依据。