本发明公开了一种有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体及其应用，其表达载体构建步骤为：一、以大肠杆菌K‑12为模板PCR扩增trpBA基因，纯化后连接到pColdI载体上，得到重组质粒trpBA‑pColdI，二、设计引物P敲除lacO‑F/P敲除lacO‑R，以trpBA‑pColdI质粒为模板进行全质粒PCR，产物经DpnI处理后转化大肠杆菌，再进行质粒扩增、培养、测序，得到敲除lacO序列的新重组质粒，再对新重组质粒的cspA启动子进行随机突变并转化大肠杆菌经扩增、培养、测序、筛选得到有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体。该方法能够避免化学诱导剂的使用，不需要调整发酵温度，从而有效降低色氨酸合成酶的生产成本，且为进一步研究启动子对基因表达的影响提供了理论基础。