本发明公开了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括PCR反应液1，PCR反应液2，DNA内控，定量参考品A、B、C、D，强阳性质控品，临界阳性质控品和阴性质控品；PCR反应液1中包括用于扩增靶多核苷酸的上、下游引物，用于检测靶多核苷酸的探针，DNA内控引物及探针，PCR反应缓冲液、dNTPs、酶混合液。本发明的试剂盒灵敏度高，最低检出限为5IU/ml；线性范围广，可覆盖20‑1.0E+09IU/ml；特异性强，针对保守区段S区序列设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰；扩增效率高，通过添加酶保护液稳定双功能酶的空间构象，增强了其活性；快速检测，整个检测过程在50分钟内完成；便于保存运输，无需冷冻及反复冻融，提高了用户使用的便捷性。