本发明公开了检测莱克多巴胺的荧光微球‑胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条及其制备方法，在底板上依次地搭接粘贴滤纸、样本垫、喷涂有荧光微球‑莱克多巴胺单克隆抗体复合物和胶体金‑莱克多巴胺单克隆抗体复合物的玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的硝酸纤维素膜上包被有莱克多巴胺偶联抗原作为检测线和包被有抗鼠抗体作为质控线。检测线显色比质控线显色浅，则样本中莱克多巴胺含量大于0.5ng/mL，定性判断为阳性。定性判断为阳性的试纸条，直接插入荧光读取仪中，读取仪将荧光微球显色体系的荧光信号数值化，实现定量检测。本发明主要用于食品安全检测中莱克多巴胺的定性与定量检测。