本发明属于发酵生产领域，具体涉及一种小量发酵生产羊毛硫细菌素Subtilomycin的方法，该发酵培养过程中的综合条件为：初始pH值8.25、转速169r/min、温度30.24℃、装液量37.9％和接种量1.46％；营养成份配比为：葡萄糖11.4g/L、酵母粉5g/L、硫酸锌0.00056g/L和氯化钙0.0595g/L，培养时间为24h，采用的发酵菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SX3411。枯草芽孢杆菌SX3411发酵液中粗分离Subtilomycin时，20％、30％和40％的硫酸铵沉淀发酵液可检测到Subtilomycin的抗菌活性，其中30％硫酸铵沉淀可获得最大量的Subtilomycin。将发酵液的30％硫酸铵沉淀用pH7.4、浓度50mmol/L的磷酸缓冲液悬浮，再通过3kD的超滤离心管，即可得到初步纯化的Subtilomycin。