一种调控米尔贝霉素合成的基因簇、重组链霉菌及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明针对目前米尔贝霉素的分离提纯困难的问题，提供了一种米尔贝霉素合成的基因簇，所述基因簇包括kelC基因、kelD基因和kelE基因；还提供了一种重组链霉菌，其相对于产生该重组链霉菌的出发菌株，基因组中基因kelC、基因kelD、基因kelE中至少一个基因是失活的，本发明还提供了所述重组链霉菌的构建方法及使用所述重组链霉菌生产米尔贝霉素的方法，本发明适用于米尔贝霉素的生产与纯化。