本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用。通过将乳酸脱氢酶、丙酰辅酶A转移酶与醇酰基转移酶同时在酿酒酵母中异源表达来实现高产乳酸乙酯。在出发菌株中完全敲除丙酮酸脱羧酶，过表达乳酸脱氢酶，以获得一定L‑乳酸产生能力的酵母菌株；选用强启动子TEF1过表达丙酰辅酶A转移酶及强启动子PGK1过表达醇酰基转移酶，以同宗配合的基因HO作为整合位点，增加一个丙酰辅酶A转移酶的拷贝数，获得乳酸乙酯显著提高的酵母菌株，其乳酸乙酯的产量达353.1mg/L，与出发菌株相比，异戊醇降低49.9％，苯乙醇降低59.2％，满足白酒相关领域对酵母的较高要求，具有广阔的应用前景。