本发明涉及医学生物工程技术领域，具体是一种新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失菌株发酵产生的新结构的新霉素衍生物及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明通过基因敲除新抗霉素生物合成基因簇中的natE基因，获得该菌株。该菌株可定向积累两个新的组分NAT‑H和NAT‑I，而不再产生新抗霉素NAT‑A和NAT‑F组分，而且新组分的产量与原有组分产量相当，并且对八种肿瘤细胞均具有显著的抑制活性，并且对大部分细胞系的抑制活性优于对照药物Cisplatin。