本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9‑OH‑AD的方法，属于生物工程和生物技术领域。本发明通过大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Mycobacterium sp.Strain VKM Ac‑1817D的3‑甾酮9α‑羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB成功在C.glutamicum ATCC13032中共表达。以此工程菌全细胞菌体作为生物催化剂，转化生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮，底物雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮的摩尔转化率达到99.5％。本发明方法生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮具有效率高，专一性强,能耗低等优点。